YY/T 1888-2023《重組人源化膠原蛋白》醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)審定通過，現(xiàn)予以公布。標(biāo)準(zhǔn)編號、名稱、適用范圍和實施日期見附件。

重組人源化膠原蛋白

1范圍

本文件規(guī)定了重組人源化膠原蛋白的質(zhì)量控制、技術(shù)要求、試驗方法、包裝、運輸和貯存等。

本文件適用于作為醫(yī)療器械原材料的重組人源化膠原蛋白的質(zhì)量控制。

注：本文件中驗證的樣品是基于重組III型人源化膠原蛋白材料。其它重組人源化膠原蛋白原材料如適用，可參考本文件。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB仃16886.1醫(yī)療器械生物學(xué)評價第1部分：風(fēng)險管理過程中的評價與試驗

GB仃16886.20醫(yī)療器械生物學(xué)評價第20部分醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)試驗原則和方法

YY/T 1465醫(yī)療器械免疫原性評價方法

YY/T 1849-2022 重組膠原蛋白

中華人民共和國藥典（2020年版）

3術(shù)語和定義

YY/T 1849-2022界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

重組人源化膠原蛋白Recombinant humanized collagen protein

由DNA重組技術(shù)制備的人膠原蛋白特定型別基因編碼的全長或部分氨基酸序列片段，或是含人膠原蛋白功能片段的組合⑴。

3.2

人膠原蛋白型別Human collagen types

人膠原蛋白在遺傳學(xué)上可以分為二十余種不同的型別，其氨基酸序列，分子組裝形式或組織分布特征存在差異。不同型別的人膠原蛋白一般由羅馬數(shù)字依次命名，比如human Type 1 collagen表示人I型膠原蛋白。每個型別的人膠原蛋白由1條或多條的膠原蛋白基因編碼組裝而成，比如人1型膠原蛋白由人C OL1A1和C OL1A2基因編碼組裝而成。

人膠原蛋白片段Humancollagenfragment

位于同一條人膠原蛋白氨基酸序列內(nèi)具有一定天然連續(xù)長度的氨基酸序列片段。

注：研究文獻顯示，人膠原蛋白序列中一般需具備天然連續(xù)21個氨基酸片段才能形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)等

4質(zhì)量控制

由于重組人源化膠原蛋白所選人膠原蛋白型別和氨基酸序列片段不同，表達體系的差異，氨基酸序列和理化性質(zhì)差異較大。需建立適宜的方法對不同批次間的產(chǎn)品進行質(zhì)量控制，包括釆用參比品和經(jīng)驗證的方法評估己知（或）潛在的成品相關(guān)物質(zhì)和對工藝相關(guān)物質(zhì)進行鑒別、理化、純度、雜質(zhì)等檢測分析。

參比品應(yīng)選擇已證明足夠穩(wěn)定或用一個代表性批次作為參比品，用于鑒別、理化、結(jié)構(gòu)表征等各種分析，參比品應(yīng)進行必要的分析鑒定，應(yīng)參照《中華人民共和國藥典》“生物制品國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備和標(biāo)定"的相關(guān)要求，宜對蛋白質(zhì)含量、等電點、純度、氮端氨基酸序列、分子量、肽圖、指紋肽圖譜庫、二硫鍵分析及糖基（酵母或其它真核細(xì)胞表達）等進行分析。

用于理化測定等方面的參比品，如用于肽圖或等電點測定的參比品，可用原液直接分裝制備，一般-70°C以下或經(jīng)驗證的貯存條件下保存。

5技術(shù)要求

5.1通則

重組人源化膠原蛋白檢測項目取決于原料來源、工藝驗證、成品一致性、工藝添加物和相關(guān)雜質(zhì)的水平。應(yīng)當(dāng)釆取適當(dāng)方法對重組人源化膠原蛋白的質(zhì)量進行檢測驗證，本技術(shù)要求適用的重組人源化膠原蛋白其型別應(yīng)能夠被明確，氨基酸序列應(yīng)能夠被檢測，蛋白純度應(yīng)能夠被測出。根據(jù)具體重組人源化膠原蛋白成品的特性，需要進行相應(yīng)的特性分析，具體特性分析及檢測項目包括如下幾個方面。

5.2理化性質(zhì)

5.2.1外觀

應(yīng)為白色/淡黃色/無色透明液體或凝膠，或白色/類白色凍干粉或海綿狀固體。

注：隨著行業(yè)發(fā)展，可能存在其他外觀要求，應(yīng)根據(jù)原材料具體形態(tài)規(guī)定外觀要求。

5.2.2可見異物

應(yīng)無明顯異物。

5.2.3水溶解性/鹽溶解性

水溶解性/鹽溶解性應(yīng)符合表1的規(guī)定。

5.2.4水分

適用時（如凍干粉），水分含量應(yīng)≤10%。

5.2.5熾灼殘渣

適用時，應(yīng)≤2.0%。

5.2.6酸堿度

適用時，酸堿度應(yīng)在5.5-8.0之間。

5.2.7等電點

應(yīng)符合YY/T1849-2022中5.3.4的規(guī)定。

5.2.8滲透壓摩爾濃度

適用時，滲透壓摩爾濃度應(yīng)在280—360mOsmol/kg之間。

5.2.9總蛋白含量

應(yīng)為標(biāo)示量的80%〜120%。

5.2.10純度

純度應(yīng)＞95%。

5.2.11裝量

單個裝量不低于標(biāo)示裝量的93%,平均裝量不低于標(biāo)示裝量。

5.3鑒別

5.3.1氨基酸序列確認(rèn)

根據(jù)《重組膠原蛋白生物材料命名指導(dǎo)原則》對重組人源化膠原蛋白定義，重組人源化膠原蛋白是由DNA重組技術(shù)制備的人膠原蛋白特定型別基因編碼的全長或部分氨基酸序列片段，或是含人膠原蛋白功能片段的組合。依據(jù)YY/T1849-2022中8.2的要求，企業(yè)應(yīng)提供產(chǎn)品全部氨基酸序列用于人源化鑒別，包含膠原蛋白類型、氨基酸長度和編輯情況等信息。氨基酸序列從氮端和碳端應(yīng)展示為人膠原蛋白某型序列的具體起止位點和編輯方式，例如用“人膠原蛋白1型alpha-1亞型(380G-641G)x2”表示人膠原蛋白I型alpha-1亞型380位到641位氨基酸直接連接重復(fù)兩次。

注1：根據(jù)定義，重組人源化膠原蛋白的氨基酸序列應(yīng)全部由人膠原蛋白特定型別的氨基酸序列全長或片段組成，最終產(chǎn)品序列中排列順序應(yīng)與人膠原蛋白排列順序一致，氮端、碳端和中部如果有人膠原蛋白以外的序列(如純化標(biāo)簽、連接序列等)不適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

注2：“部分氨基酸序列片段”通常指位于同一條人膠原蛋白氨基酸序列內(nèi)具有-定天然連續(xù)長度的氨基酸序列片段。研究文獻顯示，人膠原蛋白序列中一般需具備天然連續(xù)21個氨基酸片段才能形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)等*可：

5.3.2肽段覆蓋率(氨基酸序列覆蓋度)

根據(jù)理論序列進行對比，肽段覆蓋率應(yīng)為100%。

注：直接使用供試品檢測。應(yīng)選擇適宜的蛋白酶進行酶解，酶解后應(yīng)選擇不小于5個連續(xù)氨基酸的片段為基本的序列單元進行覆蓋分析。

5.3.3末端氨基酸序列

根據(jù)理論序列進行對比，應(yīng)與設(shè)計的理論氨基酸序列一致。

注1：其結(jié)果應(yīng)與設(shè)計的氨基酸序列完全一致。不應(yīng)含有“重組人源化膠原蛋白”定義以外的序列，即不應(yīng)含有除人膠原蛋白特定型別的氨基酸序列以外的其它氨基酸序列片段。

注2：樣品檢測前不應(yīng)經(jīng)過任何額外處理步驟。

5.3.4肽圖

應(yīng)與參比品肽圖一致。

5.3.5分子量

應(yīng)符合YY/T1849-2022中5.3.3的規(guī)定。

5.4雜質(zhì)'污染物和添加劑

5.4.1外源性DNA殘留量、宿主細(xì)胞蛋白殘留量(大腸桿菌蛋白質(zhì)殘留量、酵母蛋白質(zhì)殘留量、CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量)、肽聚糖及添加劑應(yīng)符合YY/T1849-2022中5.5的規(guī)定：無菌、微生物限度應(yīng)符合YY/T1849-2022中5.9.2和5.9.3的規(guī)定。

5.4.2重金屬及微量元素含量

重金屬及微量元素含量應(yīng)符合以下規(guī)定：

a) 對工藝中添加的重金屬元素，應(yīng)符合規(guī)定值限；

b) 重金屬總量(以Pb計)應(yīng)<10gg/g：

c) 微量元素含量：碑(As)<1ng/g,汞(Hg)<4gg/g,鉛(Pb)<10gg/g,絡(luò)(Cr)、鎘(Cd)、銅(Cu)、鉬Mo)、鐵(Fe)、鎳(Ni)總量應(yīng)≤50mg/g。

5.4.3殘余抗生素含量

應(yīng)≤50ng/mg。

5.4.4殘余抗生素活性

應(yīng)無殘余抗生素活性。

5.4.5細(xì)菌內(nèi)毒素

應(yīng)符合YY/T1849-2022中5.9.3的規(guī)定。

5.5結(jié)構(gòu)表征

5.5.1氨基酸異質(zhì)性分析

5.5.1.1脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾等

適用時，應(yīng)按YY/T1849-2022中5.7.1的要求進行分析。

5.5.1.2脯氨酸羥基化

適用時，應(yīng)符合YY/T1849-2022中5.7.7的規(guī)定。

5.5.2高級結(jié)構(gòu)分析

應(yīng)釆用多種方法對重組人源化膠原蛋白高級結(jié)構(gòu)進行研究分析，包括以下列舉的方法及其他結(jié)構(gòu)表征方法（如冷凍電鏡、蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)等方法）。

5.5.2.1圓二色（CD）光譜

適用時，重組人源化膠原蛋白的CD譜圖應(yīng)在195nm附近有負(fù)峰，在221nm附近有正峰。

注：應(yīng)標(biāo)示樣品的實驗檢測條件，可按照YY/T1849-2022中5.7.4描述的方法進行分析。

5.522微量差示掃描量熱譜

適用時，樣品吸收峰（Tm值）應(yīng)與參比品吸收峰（Tm值）基本一致，偏差應(yīng)在±6°C之間。

注：應(yīng)標(biāo)示樣品的實驗檢測條件，在實驗條件下有吸收峰表明有結(jié)構(gòu)的變化。

5.523紅外光譜

適用時，紅外光譜圖的非特征區(qū)（如：酰胺a、b）和特征區(qū)（如:酰胺I、酰胺II、酰胺III）的特征峰位置應(yīng)與參比品一致。波數(shù)偏差應(yīng)在±0.5%cm』之間。

5.5.2.4拉曼光譜

樣品的拉曼光譜圖應(yīng)與參比品一致。

6試驗方法

6.1理化性質(zhì)

6.1.1外觀

用肉眼直接觀察，結(jié)果應(yīng)符合5.2.1的規(guī)定。

6.1.2可見異物

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0904可見異物檢查法第一法（燈檢法）進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.2.2的規(guī)定。

6.1.3水溶解性/鹽溶解性

稱取適量樣品，溶解于25°C±2°C一定體積的溶劑中，每隔5min強力振搖30s；觀察30min內(nèi)的溶解情況，如無目視可見的溶質(zhì)顆�；蛞旱螘r，即視為完全溶解。結(jié)果應(yīng)符合5.2.3的規(guī)定。

注：本文件規(guī)定的鹽溶解性為pH7.4的PBS溶液溶解。

6.1.4水分

除另有規(guī)定外，取樣品1.0〜2.0g,按照YY/T1849-2022中5.2.4中描述的方法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.2.4的規(guī)定。

6.1.5熾灼殘渣

除另有規(guī)定外，取樣品1.0-2.0g,按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0841熾灼殘渣檢查法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.2.5的規(guī)定。

6.1.6酸堿度

液體和凝膠樣品直接取樣，固體樣品用生理鹽水稀釋為lmg/mL按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0631pH值測定法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.2.6的規(guī)定。

6.1.7等電點

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0541電泳法第六法（等電聚焦電泳法）或0542毛細(xì)管電泳法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.2.7的規(guī)定。

6.1.8滲透壓摩爾濃度

液體和凝膠樣品直接取樣，固體樣品用生理鹽水稀釋為lmg/mL按照《中華人民共和國藥典》

2020年版四部通則0632滲透壓摩爾濃度測定法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.2.8的規(guī)定。

6.1.9總蛋白含量

總蛋白含量的測定按照YY/T1849-2022中5.6描述的方法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.2.9的規(guī)定。

6.1.10純度

6.1.10.1色譜法

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0521高效液相色譜法或0514分子排阻色譜法進行檢測，按面積歸一化法計算純度，其結(jié)果應(yīng)符合5.2.10規(guī)定。

6.1.10.2電泳法

按照YY/T1849-2022中5.4.1描述的方法進行檢測，其結(jié)果應(yīng)符合5.2.10規(guī)定。

6.1.11裝量

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0942最低裝量檢查法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.2.11的規(guī)定。

6.2鑒別

6.2.1氨基酸序列確認(rèn)

根據(jù)企業(yè)提供的產(chǎn)品氨基酸序列，將氨基酸序列與人膠原蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對，如NCBI數(shù)據(jù)庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）,比對結(jié)果應(yīng)符合5.3.1的規(guī)定。

6.2.2肽段覆蓋率（氨基酸序列覆蓋度）

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0431質(zhì)譜法進行檢測，分析結(jié)果應(yīng)符合5.3.2的規(guī)定。

肽段覆蓋率（氨基酸序列覆蓋度）（％）=（鑒定肽段的氨基酸個數(shù)/理論氨基酸個數(shù)）X100%。

注1：肽段覆蓋率是指檢測到的肽段的氨基酸數(shù)量占該蛋白質(zhì)總氨基酸數(shù)量的比例。蛋白質(zhì)經(jīng)過酶切后，釆用LC-MS進行檢測，鑒定到的酶切后肽段占理論序列氨基酸數(shù)量的比例。.

注2：應(yīng)直接使用供試品進行酶切，不得使用電泳跑膠后切膠，且酶解后應(yīng)釆用不小于5個連續(xù)氨基酸的片段為基本的序列單元，同時應(yīng)不含有任何非人源膠原蛋白的序列片段。

注3：如胰蛋白酶或一種酶不能水解，選擇適宜的其他蛋白酶，結(jié)合多種酶切的鑒定結(jié)果，進行肽段覆蓋率計算。

6.2.3末端氨基酸序列

用氨基酸序列分析儀或質(zhì)譜法測定氮端和/或碳端氨基酸序列，結(jié)果應(yīng)符合5.3.3的規(guī)定。

注1：應(yīng)直接使用供試品或者取供試品溶解后直接上樣。

注2：每年應(yīng)至少檢測一次。

6.2.4肽圖

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則3405肽圖檢查法第一法（胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法）進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.3.4的規(guī)定。

注：如胰蛋白酶不能水解.選擇適宜的其他蛋白酶。

6.2.5分子

按照YY/T1849-2022中5.3.3描述的方法進行檢測，其結(jié)果應(yīng)符合5.3.5規(guī)定。

6.3雜質(zhì)'污染物和添加劑

6.3.1外源性DNA殘留量

按照YY/T1849-2022中5.5.2描述的方法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.4.1的規(guī)定。

6.3.2.1大腸桿菌蛋白質(zhì)殘留

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則3412大腸埃希菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測定法或采用經(jīng)驗證的酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.4.1的規(guī)定。

63.2.2酵母蛋白質(zhì)殘留量

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則3414酵母工程菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測定法或采用經(jīng)驗證的酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.4.1的規(guī)定。

632.3CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量

采用經(jīng)驗證的酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.4.1的規(guī)定。

6.3.3肽聚糖

若重組人源化膠原蛋白的生產(chǎn)過程有可能引入肽聚糖(促炎性污染物)的風(fēng)險，釆用經(jīng)驗證的方法或經(jīng)驗證的市售細(xì)菌肽聚糖檢測試劑盒(ELISA)進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.4.1的規(guī)定。

6.3.4添加劑含量

如果使用了防腐劑、凍干保護劑等添加劑應(yīng)給出相應(yīng)的檢測方法，按給出的檢測方法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.4.1的規(guī)定。

6.3.5無菌

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1101無菌檢査法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.4.1的規(guī)定。

6.3.6微生物限度

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法和1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.4.1規(guī)定。

6.3.7重金屬及微■元素含量

6.3.7.1重金屬總量

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0821重金屬檢查法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.4.2的規(guī)定。

63.7.2微量元素含量

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0406原子吸收分光光度法、0411電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法或0412電感耦合等離子體質(zhì)譜法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.4.2的規(guī)定。

6.3.8殘余抗生素含量

殘余抗生素含量的測定按照YY/T1849-2022中5.5.6描述的方法或其他經(jīng)驗證的方法進行檢測，

6.3.9殘余抗生素活性

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1200生物活性測定法中1201抗生素微生物檢定法或《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則3408抗生素殘留量檢查法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合544的規(guī)定。

6.3.10細(xì)菌內(nèi)毒素

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法或9251細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則“重組C因子法”進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.4.5規(guī)定。

6.4結(jié)構(gòu)表征

6.4.1氨基酸異質(zhì)性分析

6.4.1.1脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾等

按照YY/T1849-2022中5.7.1和5.7.8描述的方法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.5.1.1的規(guī)定。

6.4.1.2脯氨酸羥基化分析

按照YY/T1849-2022中5.7.7描述的方法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.5.1.2的規(guī)定。

6.4.2高級結(jié)構(gòu)分析

6.4.2.1圓二色(CD)光譜

按照附錄A規(guī)定的方法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.5.2.1的規(guī)定。

6.4.2.2微量差示掃描量熱譜

按照附錄B進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.5.2.2的規(guī)定。

6.4.23紅外光譜

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0402紅外分光光度法進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.523的規(guī)定。

6.4.2.4拉曼光譜

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0421拉曼光譜法(建議入射光與所檢測的拉曼散射光之間的夾角為0°或90�；�180°)進行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.5.2.4的規(guī)定。

7穩(wěn)定性

重組人源化膠原蛋白穩(wěn)定性受多種因素影響，包括純化工藝、微生物負(fù)載、包裝貯存條件等。重組人源化膠原蛋白的穩(wěn)定性變化，如降解，可能會直接影響預(yù)期用于醫(yī)療器械產(chǎn)品的安全性和有效性，因此，應(yīng)對其穩(wěn)定性進行動態(tài)評價和分析。與穩(wěn)定性相關(guān)的工藝驗證宜采用連續(xù)三批次重組人源化膠原蛋白進行。在工藝條件有變化時，應(yīng)考慮對重組人源化膠原蛋白穩(wěn)定性的影響，必要時進行再次驗證。

8生物學(xué)評價

作為制備醫(yī)療器械產(chǎn)品的原材料，應(yīng)按照GB/T16886.1的要求對重組人源化膠原蛋白進行相應(yīng)必要的生物學(xué)評價，如預(yù)期用于植入產(chǎn)品的原材料，還應(yīng)評估樣品是否為內(nèi)源性凝血系統(tǒng)激活物。

基于部分人膠原蛋白氨基酸序列進行編輯組合重組制備的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，特別是長期反復(fù)使用時,可能引起人體預(yù)測不到的免疫原性。需進行免疫學(xué)研究，試驗方法可參照GB116886.20及YY/T1465系列標(biāo)準(zhǔn)。

重組人源化膠原蛋白作為醫(yī)療器械用原材料，可釆用適宜方法，進行免疫學(xué)評價。若用動物進行免疫學(xué)試驗，可能因為動物模型與臨床應(yīng)用之間存在種屬差異，帶來對評價試驗結(jié)果或評價試驗數(shù)據(jù)使用上的局限，應(yīng)當(dāng)根據(jù)臨床試驗獲得的免疫學(xué)評價數(shù)據(jù)及動物模型獲得的免疫評價數(shù)據(jù)進行綜合評價分析。

9包裝、運輸和貯存

應(yīng)符合YY/T1849-2022中8.1、8.2的規(guī)定。